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绵羊痘病毒GY株的分离鉴定与靶向其RNA聚合酶基因siRNA的筛选.pdf 48页

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摘要 skindisease 病毒(Lumpy 引起绵羊痘、山羊痘和牛结节性疹块病。近年来,绵羊痘在我国多地发生,大量绵羊患病死亡, 给养殖业带来极大的经济损失。SPPV的基因组在侵入宿主细胞前由衣壳保护,衣壳在病毒侵入 宿主细胞后,在适当的时间和位置被内在的环境所解离,使病毒基因组快速释放到细胞质中进行 复制。因此,SPPV能否在细胞中增殖的一个决定因素就是病毒能不能脱去衣壳。脱壳过程依赖 予RNA和蛋白质的合成。目前,引起绵羊痘病毒脱壳的脱壳蛋白的结构和功能及其编码基因, 以及转录脱壳蛋白的RNA聚合酶亚基尚不知晓。本研究在成功分离鉴定一株绵羊痘病毒的基础 上,初步进行了绵羊痘病毒RNA聚合酶基因的干扰的研究,为探究RNA聚合酶与脱壳的相关性 奠定了基础。 取发病绵羊的皮肤痘疹研磨制成病料样品悬液,将该悬液感染未免疫绵羊,同时接种原代羔 羊睾丸(LT)细胞,盲传5代后,转接Veto细胞,进行间接免疫荧光和PCR鉴定。样品悬液感 染未免疫绵羊后出现羊痘典型发病症状,经过LT细胞传代后转接Vero细胞,出现了特征性细胞 病变,免疫荧光和PCR均检测出病毒存在。PCR产物核酸序列测定结果显示,分离毒株的基因 片段与已发表的绵羊痘病毒毒株的相应基因片段同源性在99%以上。上述结果表明,本研究从宁 GY株。 夏固原疑似羊痘病毒感染的绵羊中成功分离到1株SPPV·,命名为SPPV version 析,确定了其稳定性和保守性,为设计靶向siRNA提供理论基础。采用设计软件siDirect 2.0进行siRNA的设计和初步评估,尽可能的规避脱靶效应,为两条目的基因分别最终确定选用 3个siRNA作为进一步实验验证的靶标分子。 分别与靶向目的基因的重组pEGFP-N1载体共转染,确定6条siRNA均有抑制作用,且其中靶向 SPPVORF05l基因的siRNA2与靶向SPPVORF065基因的siRNA3效果最好。 以GY株病毒接种至Vero细胞,间隔8h收取培养液和细胞,以此建立了病毒一步生长曲线。 由一步生长曲线确定最佳收毒时间为88h。将目的基因重组于plv.puro载体,通过嘌呤霉素加压 筛选建立了SPPV-ORF051和SPPV-ORF065稳定表达的Vero细胞系。 了解病毒在宿主细胞内感染的动力学,同时为本研究中的RNA干扰试验提供工具。构建稳定表 达两个RNA聚合酶的Vero细胞系,为探究过表达的RNA聚合酶对于病毒脱壳的影响。以GPF 为报告基因,获得了最佳抑制效果的siRNA,为进一步研究RNA聚合酶与脱壳的关系奠定了基 础。 关键词:SPPV,GY株,一步生长曲线,细胞系,siRNA 万方数据 Abstract the isa ofvirusesinthe and familyPoxviridae, genus subfamilyChordopoxvirinae Capripoxvirus disease skin virus consistsofthree virus(GTPV),andlumpy species:sheeppoxvirus(SPPV),goatpox

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